IPLA2介导的脂质解毒作用控制非Gp [复制链接]

研究背景：P53抑癌基因的失活是大多数人类癌症形成过程中的关键事件。虽然p53的经典活性(包括细胞周期阻滞、凋亡和衰老)被广泛认为是肿瘤抑制的主要机制，但最近的研究表明，非常规机制也对肿瘤抑制起着重要作用。类似于细胞凋亡的铁死亡是一种抑制肿瘤生长的新工具；虽然目前Gpx4抑制剂已被认为是很有希望用于癌症治疗的药物，但p53通过一条不依赖于Gpx4的独特途径促进铁死亡，所以目前还不清楚是否有Gpx4样因子参与调节p53依赖性的铁死亡肿瘤抑制。

结果解读

P53介导的铁死亡不依赖于ROS诱导的应激反应

为了解决p53介导的铁死亡是否可以独立于Gpx4功能诱导的问题，研究者构建了人骨肉瘤细胞系U2OS的ACSL4/Gpx4双基因敲除衍生物。发现p53水平不受ACSL4和Gpx4缺失的影响，p53介导的p21或p53介导的转录激活对SLC7A11的抑制保持不变（图1A）。此外，因为它们缺乏ACSL4，这些细胞对Erastin(图1B)或Gpx4抑制剂RSL?3(图1C)引起的铁死亡具有抵抗力。而当ACSL4/Gpx4阴性细胞同时暴露于ROS发生器TBH和p53激活剂Nutlin时，则很容易观察到铁死亡(图1D)。此外，这些p53介导的反应可被FERR?1、DFO和Lipro-1这些铁死亡抑制剂特异性阻断，但不能被其他细胞死亡途径的抑制剂所阻断，如凋亡、自噬或坏死(图1D)。

图1

BTP或CMH具有与TBH相似效果

接着他们研究了P53介导的铁死亡是否可以被其他可产生ROS的化合物如DDM?9，2丁酮过氧化物和异丙苯过氧化氢诱发。发现在相同的条件下，这两种化合物都很容易诱导亲本细胞和ACSL4/Gpx4缺失的U2OS细胞发生高水平的铁死亡(图2B，C)。此外，在C11-BODIPY染色的流式细胞术观察到，当亲代细胞或ACSL4/Gpx4缺失细胞同时用Nutlin和TBH处理时，ROS水平升高(图2D，E)。

图2

IPLA2β在不同的应激水平下受p53的差异调节

通过分析RNA-Seq数据，研究者发现iPLA2β的DNA表达水平是由p53激活诱导的。他们检测了iPLA2β的DNA的表达，在表达野生型p53的细胞系(U2OS，MCF7，A，A细胞)中，经Nutlin或阿霉素处理后，iPLA2β的表达水平略有上调，但在p53缺失的细胞系H中没有上调(图3A)。又评估了由CRISPR介导的p53基因失活产生的U2OS亚系。用p53特异性抗体进行的染色质免疫沉淀(CHIP)，发现p53对RE2和Re3有显著的募集作用，但对Re1没有影响，其水平与p53的著名代谢靶点TIGAR27启动子的水平相当(图3D)。

图3

P53介导的iPLA2β的差异效应取决于应激时间和强度

接着研究者检测了不同剂量的相同处理在p53介导的反应过程中iPLA2β的水平。发现iPLA2β水平在较早的时间点被诱导，但在Nutlin治疗后的较晚时间点被完全取消(图4A，b)。而在所有不同的时间点都观察到p53介导的p21调节(图4A)。P53诱导的SLC7A11在不同时间点均保持完好(图4a-c)。当同时用Nutlin和TBH处理细胞时，也获得了类似的数据(图4d-f)。此外，在HCT和U2OS细胞中，低剂量的DNA损伤试剂可诱导iPLA2DNA的激活，而高剂量的相同试剂可显著抑制其激活。

综上，iPLA2β是p53的直接靶点，但p53介导的iPLA2β的调节对治疗条件非常敏感。

图4

IPLA2β是p53介导的铁死亡的主要抑制因子

为了研究iPLA2β在调节p53功能中的作用，他们首先检测了RNA干扰介导的内源性iPLA2β下调是否影响人黑色素瘤A细胞中p53依赖的铁死亡。他们将针对iPLA2β的siRNA转染A细胞和p53缺失的A细胞。通过Westernblot分析，发现siRNA介导的iPLA2β缺失并不影响p53或其转录靶p21的表达水平(图5A)，转染对照siRNA的TBH处理细胞很容易诱导p53介导的铁死亡。而在p53缺失的细胞中没有观察到明显的影响(图5B)，这表明iPLA2β可以抑制p53介导的铁死亡(图5B)。iPLA2β敲除显著增强了p53介导的铁死亡（图5C）。接着研究者在A细胞中敲除了iPLA2β基因。发现iPLA2β表达缺失对p53水平和p53转录功能没有明显影响(图5D)，但在iPLA2β缺失的细胞中，p53介导的铁死亡在不同时间点显著增加(图5e)。在U2OS细胞中也得到相同结果。

图5

IPLA2β是p53介导的肿瘤抑制因子的主要抑制因子

为了阐明iPLA2β在铁死亡调节中的生理意义，研究者在异种移植瘤模型中检测了iPLA2β表达缺失是否影响肿瘤生长。在异种移植瘤生长分析中，iPLA2β表达失活后，人黑色素瘤A异种移植瘤的生长显著减少(图6a，b)；而当使用同基因p53缺失的A细胞时，iPLA2β表达缺失所诱导的肿瘤抑制作用在很大程度上被取消(图6a，b)。值得注意的是，在iPLA2β?/?肿瘤样本中观察到铁死亡的标志物PTGS2的上调，但在iPLA2β?/?/p53?/?样本中没有观察到(图6C)。他们又在人肺癌A细胞中进行了一系列类似的实验。同样，iPLA2β的敲除显著增强了p53介导的铁死亡(图6D)。以上数据表明通过敲除iPLA2β而激活的铁死亡在一定程度上参与了抑制体内p53依赖性肿瘤的生长。

图6

IPLA2β可下调ROS诱导的过氧化膜脂水平，有效抑制p53诱导的铁死亡。

接着研究者将编码ALOX12或ALOX12和iPLA2β(图7A)的表达载体转染U2OS细胞，对其进行C11-BODIPY染色，流式细胞仪分析细胞膜内源性脂质过氧化水平。发现ALOX12的表达显著增加了过氧化脂质水平，而当iPLA2β共表达时，这些升高的水平被有效地降低（图7B,C）。用编码iPLA2β或iPLA2γ的表达载体转染ACSL4/Gpx4缺失的U2OS细胞作为额外的对照(图7D)。发现在ACSL4/Gpx4缺失细胞(I)中，iPLA2β(II)的表达显著降低了在ROS应激下由p53激活引起的脂质过氧化水平的升高，但iPLA2γ的表达并未显著降低(III，图7E)。接着他们进行了有针对性的脂质组学研究，发现氧化磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)显著诱导ALOX12的表达(图7g，h)。为了检验iPLA2FSP1介导的铁死亡是否可以独立于β功能而诱导，又制备了人骨肉瘤细胞系U2OS的FSP1衍生物。结果表明FSP1缺失的细胞对Gpx4抑制剂RSL-3诱导的铁死亡更敏感，而iPLA2β有效地抑制了这些细胞中的细胞死亡(图8A，b)。综上，iPLA2β介导的治疗铁死亡的作用完全不依赖于Gpx4或Fsp1。

图7

总结：iPLA2βG是不依赖于是GPX4的铁死亡抑制因子。iPLA2β的敲除对正常组织的正常发育或细胞活力没有明显影响。表明了iPLA2β介导的脂质解*在抑制p53介导的铁死亡和肿瘤抑制中起重要作用，并提示iPLA2β是激活人类癌症中铁死亡的一有前途的靶点。

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